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賽默飛發布下一代表征利器Orbitrap Eclipse™質譜儀
點擊次數:3365 發布日期:2019-6-27  來源:本站 本站原創,轉載請注明出處

生物制品下一代表征利器創新巔峰Orbitrap Eclipse™質譜儀

本期帶大家領略2019 ASMS發布新品質譜儀如何將生物制品質譜表征工作變得更簡單、看到生物制品最真實的原貌!

當前常規生物制品質譜表征主要包含完整分子量的測定、肽圖解析、糖型鑒定等,通常利用不同的樣品前處理獲得復雜生物制品的完整分子量、氨基酸序列結果,然而在一定程度上卻失去了樣品的完整信息,引入其他副反應。大家知曉可以用Top-Down、Middle-Down的分析流程解決這一問題,但由于質譜儀性能的局限,未得到廣泛的應用。
 
賽默飛作為科研領域的領導者,致力于解決分析難題,全能型Orbitrap Eclipse™將“簡單又復雜”的生物制品質譜表征帶入了“Top/Middle-Down時代”
 

 
1復雜生物制品的完整分子量測定——糖基化位點較多的融合蛋白類
 
得益于PTCR(質子轉移電荷減少)技術、深度真空技術(氣壓可調0.5-20mTorr)。
 
單克隆抗體及ADC類蛋白樣品異質性相對較低,在傳統的LC-MS/MS(變性反相色譜或非變性分子排組色譜條件)中能夠獲得高信噪比、高質量精度的各成分及其含量分布。而含N-糖或O-糖位點較多的融合蛋白類,如細胞因子融合蛋白,異質性非常高,即使在非變性去唾液酸條件下仍舊無法有效區分每一成分(圖1A),通常的解決方式是使用各種糖苷酶去除不同種類糖型,降低譜圖復雜性,然而卻失去了樣品的完整水平糖型信息。
 

圖1. 細胞因子融合蛋白分子量測定; 1A. 去唾液酸后在native條件質譜圖 1B.經過PTCR反應后質譜圖 1C.經BioPharma軟件去卷積后的各成分質量(Data Courtesy: Wendy Sandoval, Genentech)
 
Orbitrap Eclipse™ 針對不同的樣品分析可調節IRM中氣壓,提高信號響應,以及PTCR強力的加持技術則可簡單快速的解決此類困擾已久的難題,如圖1所示,在圖1A中選擇帶多質子且信號強度較高的m/z5677-5757范圍,經PTCR反應后降低質子數,從而降低各電荷態間的重疊度(圖1B),此時可清晰的分辨每一成分,BioPharma Finder軟件去卷積后獲得該融合蛋白主要成分的分子量(圖1C),為復雜生物制品的表征提供完整信息。
 
2非變性蛋白Top-Down分析
 
得益于ETD、EThcD、UVPD、HCD、深度真空技術、HMRⁿ、PTCR技術
(全能型Orbitrap Eclipse™三合一質譜儀集各種利器于一身)
 
對于做蛋白藥物質譜表征分析的人來說,理想的狀態是使用快速簡單甚至無需樣品前處理,直接進入LC-MS/MS或MS only對蛋白藥物進行表征高效且降低樣品前處理引入的干擾,同時可直接對電荷變異體成分進行快速的確證。而現實是由于抗體分子大,碎片離子少且復雜導致在完整蛋白水平獲得較低的序列覆蓋度,實用價值低。Orbitrap Eclipse™將非變性完整蛋白Top-Down分析推向嶄新的高度。
 
以Herceptin®抗體為例,溶液置換成50mM乙酸銨(Herceptin®濃度為2ug/uL),不經LC通過注射泵直接進入MS中,獲得高信噪比高質量精度的一級譜圖(圖2),隔離豐度最高的母離子(+27價)分別進行HCD、ETD、EThcD及UVPD的碎裂,且使用Orbitrap 240,000分辨率進行高準確度二級碎片離子掃描,由于Orbitrap Eclipse™具有HMRⁿ選項,可在二級譜圖中看到m/z達8000的豐富碎片離子。
 

 
圖2.非變性Herceptin®高質量精度的一級質譜圖,不同碎裂模式下的二級質譜圖
 

圖3. 經BioPharma Finder解析后輕重鏈氨基酸序列覆蓋度
 
經BioPharma Finder解析后,輕鏈氨基酸序列覆蓋度為57%,重鏈氨基酸序列覆蓋度為36%(圖3),碎片離子質量偏差在3ppm以內,Orbitrap Eclipse™在非變性條件下Top-Down結果刷新了以往的記錄⁽¹⁾。
 
值得注意的是,PTCR技術不僅在復雜生物制品分子量測定中大顯身手,而且能夠顯著降低ETD MS²譜圖的復雜度(圖4),大大提高質量碎片離子的解析度(圖5),從而提升Middle-Down氨基酸序列的覆蓋度(圖6)。
 

圖4.NIST mAb Fd亞基經ETD碎裂以及PTCR反應后的二級碎片離子質譜圖
 

圖5.ETD only與ETD with PTCR二級/三級碎片離子鑒定分布圖
 

圖6.NIST標準抗體Middle-Down氨基酸序列覆蓋度
 
3基于以上獨特的優勢性能,可進一步擴展其應用領域
 
如電荷變異體的快速鑒定;利用MHC(Major Histocompatibility Complex)-peptide復合物篩選高免疫原性疫苗時,采用Orbitrap Eclipse™測定復合物的完整分子量和Top-Down,來評估多肽的交換(圖7);此外多種碎裂方式與超高分辨率Orbitrap的組合能夠更加準確的對未知蛋白進行從頭測序(De-novo sequencing)。
 

圖7.Orbitrap Eclipse™評估MHC與多肽的交換,助力高免疫原性疫苗的篩選(Data Courtesy :Genentech)
 
結語:目前Orbitrap Eclipse™是功能最為齊全的高分辨質譜儀之一,旨在解決蛋白質分析中極具挑戰的問題,持此利器定能推動生物學研究的進一步發展。
 
至此,ASMS新品連載正式完結啦!快和賽默飛一起回顧下賽默飛2019新品質譜的精彩瞬間~
 
賽默飛于ASMS 2019上發布的兩款新品質譜再次刷新了Orbitrap的記錄——
 
全新一代Q Orbitrap旗艦機 Orbitrap Exploris™480 質譜儀,體積小巧但性能超強,穩定耐久。天才不“繁”,勢必將蛋白質組學,尤其是臨床蛋白質組學研究推向新的高度。
 
堪稱創新巔峰之作的全能型Orbitrap Eclipse™三合一質譜儀,集各種高能軟硬件技術于一身,性能比尖,輕松應對蛋白質組學,生物制藥與蛋白質高級結構分析研究中的各項挑戰。
索取資料
相關公司:賽默飛世爾科技(色譜與質譜)
聯系電話:400 611 9236
E-mail:menglu.xing@thermofisher.com


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